摘要：丹波黑大豆(Glycine max’Tamba’)是一種耐鋁植物,其耐鋁機(jī)制是根尖分泌檸檬酸絡(luò)合鋁離子。為了發(fā)掘其優(yōu)異的耐鋁基因資源,本研究以丹波黑大豆鋁脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),利用反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)克隆了1個編碼丹波黑大豆檸檬酸通道蛋白基因,命名為GmMATE2(GenBank No. MF497433.1)。該基因的CDS序列長度為1 674 bp,預(yù)測編碼557個氨基酸,分子量為60.38 kD,等電點為9.54。GmMATE2蛋白不穩(wěn)定性指數(shù)為28.38,是穩(wěn)定蛋白質(zhì)。氨基酸序列分析表明,GmMATE2含有9個跨膜結(jié)構(gòu)、1個PolysaccsyntC結(jié)構(gòu)域及2個多藥及毒性復(fù)合物排出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(multidrug and toxic compound extrusion, MATE)家族特有的MatE結(jié)構(gòu)。進(jìn)化樹分析表明,GmMATE2與蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、白車軸草(Trifolium repens)和鷹嘴豆(Cicer arietinum)的MATE蛋白親緣關(guān)系較近。丹波黑大豆在鋁脅迫(pH 4.5, 0.5 mmol/L CaCl2, 100μmol/L AlCl3)下,利用半定量RT-PCR分析表明,GmMATE2在根尖上調(diào)表達(dá),24 h時表達(dá)量最高,根尖檸檬酸的分泌量隨著時間的延長而增多,表明該基因參與鋁脅迫反應(yīng)。構(gòu)建過表達(dá)載體pBI121-GmMATE2,利用農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana tabacum),獲得3株轉(zhuǎn)基因煙草植株。對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行耐鋁分析,在鋁脅迫(pH 4.5, 0.5 mmol/L CaCl2, 50μmol/L AlCl3)下,qRT-PCR分析表明,在轉(zhuǎn)基因煙草中GmMATE2上調(diào)表達(dá);轉(zhuǎn)基因煙草根尖檸檬酸分泌量是野生型的2.56~3.79倍;轉(zhuǎn)基因煙草根相對伸長量是野生型的1.91~3.45倍;轉(zhuǎn)基因煙草根尖鉻天青S染色較野生型淺。上述結(jié)果表明,丹波黑大豆GmMATE2是檸檬酸通道蛋白基因,能提高轉(zhuǎn)基因煙草檸檬酸分泌量及耐鋁性。本研究為改良鋁敏感植物的耐鋁性提供了基因資源。