摘要：目的運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建EIF5A2基因敲除Cal27細(xì)胞系,觀察EIF5A2在口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖與遷移中的作用。方法根據(jù)EIF5A2基因結(jié)構(gòu)域,設(shè)計(jì)2個(gè)CRISPR靶向位點(diǎn),利用pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin構(gòu)建2個(gè)導(dǎo)向RNA(sgRNA)質(zhì)粒。將sgRNA質(zhì)粒與pST1374-NLS-flag-linker-Cas9共轉(zhuǎn)染至Cal27細(xì)胞中,用嘌呤霉素和殺稻瘟菌素篩選,并挑取單克隆。將單克隆細(xì)胞的DNA進(jìn)行目的片段擴(kuò)增,經(jīng)凝膠電泳及測(cè)序鑒定后篩選出大片段敲除細(xì)胞株Cal27-2C5及堿基突變株Cal27-2D1。real time PCR及WesternBlot鑒定兩株細(xì)胞系中EIF5A2的表達(dá)情況。用Transwell實(shí)驗(yàn)及CCK8分別檢測(cè)EIF5A2敲除對(duì)Cal27細(xì)胞的體外遷移能力及體外增殖能力的影響。結(jié)果與對(duì)照組相比,Cal27-2C5及Cal27-2D1細(xì)胞株中EIF5A2在mRNA水平上表達(dá)均明顯降低。在蛋白水平上,Cal27-2C5及Cal27-2D1細(xì)胞株中EIF5A2蛋白均基本不表達(dá)。敲除EIF5A2可明顯降低Cal27細(xì)胞的體外遷移能力,而對(duì)Cal27細(xì)胞體外增殖能力沒有明顯影響。結(jié)論成功構(gòu)建EIF5A2基因敲除Cal27細(xì)胞株Cal27-2C5和Cal27-2D1,并初步驗(yàn)證EIF5A2可以影響Cal27細(xì)胞的體外遷移能力。